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Title: Genetic and biochemical analysis of the multi-glycosyltransferase complex responsible for seed mucilage rhamnogalacturonan l synthesis

Abstract

Pectin is a polysaccharide and as a major component of cell walls is involved in various fundamental processes in plant development. The pectin domain rhamnogalacturonan I (RG-I) has a backbone composed of a repeating rhamnose and galacturonic acid disaccharide, with side chains of other sugars. Copious amounts of RG-I are accumulated in seed mucilage, which is synthesized in seed epidermal cells during seed development. Investigation of Arabidopsis mucilage mutants has yielded new insights into glycosyltransferases (GTs) involved in RG-I synthesis. In this thesis, I have investigated the potential coordination of RG-I synthesis by a multi-GT complex and how different GTs contribute to RG-I synthesis. Six candidate GTs were selected whose mutants exhibit mucilage production defects, and interactions between them were analyzed using biomolecular fluorescence complementation and co-immunoprecipitation techniques. To generate different multi-GT mutant combinations, both a CRISPR/Cas9-based approach and crosses between T-DNA insertion mutants were employed. Mucilage amounts, composition and macromolecular properties were examined in mutant seeds to investigate the interdependence of GT activities in the synthesis of mucilage polysaccharides. Biochemical analyses of macromolecular characteristics in various GT mutants and the results of interaction assays allow a model to be proposed for RG-I production in relation to the synthesis of two other polysaccharide domains, homogalacturonan and xylan.

Keywords: Glycosyltransferase, mucilage, pectin, rhamnogalacturonan l, seed

Résumé en français :

Les pectines constituent l’un des polysaccharides principaux de la paroi cellulaire végétale et sont impliqués dans de multiples processus fondamentaux relatifs au développement des végétaux. Le domaine pectique rhamnogalacturonane I (RG-I) possède un squelette constitué d’une alternance d’unités rhamnose et acide galacturonique branches par des chaînes latérales osidiques diverses. D’importantes quantités de RG-I sont accumulées dans le mucilage séminal qui est synthétisé au cours du développement de la graine. Les recherches menées sur les mutants affectant le mucilage chez Arabidopsis ont permis des avancées sur la compréhension des glycosyltransférases (GTs) impliquées dans la synthèse du RG-I. Au cours de cette thèse, j’ai étudié la façon dont les différentes GTs contribuent à la synthèse du RG-I, potentiellement de façon coordonnée grâce à un complexe multi-enzymatique. Six GTs candidates dont les mutants présentaient des défauts de production du mucilage ont été sélectionnées et leurs interactions ont été étudiées par complémentation de fluorescence bimoléculaire et par co-immunoprécipitation. Différentes combinaisons de mutants ont été générées par des approches CRISPR/Cas9 et par croisement entre mutants d’insertion ADN-T. Les quantités de mucilage produit et ses caractéristiques biochimiques et macromoléculaires ont été analysées pour les différents mutants. L’ensemble des données produites nous a permis de proposer un modèle de synthèse du RG-I en articulation avec la synthèse de deux autres polysaccharides, les homogalacturonanes et les xylanes.

Composition du jury

-       Elisabeth JAMET, Directeur de recherche, CNRS, Rapporteur

-       Patrice LEROUGE, Professeur, Université de Rouen Normandie, Rapporteur

-       Anne-Laure CHATEIGNER-BOUTIN, Chargée de recherche, INRAE, Examinateur

-       Debra MOHNEN, Professeur, University of Georgia, Examinateur

-       Jérôme PELLOUX, Professeur, INRAE/ Université de Picardie Jules Verne, Examinateur

-       Carole PROST, Professeur, ONIRIS, Examinateur

-       Marie-Christine RALET, Directrice de recherche, INRAE Co-directrice de thèse

-       Helen NORTH, Directrice de recherche, INRAE Co-directrice de thèse