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La thèse s’intitule : Assessing the activity of a modular AA9 LPMO on cellulosic substrates. Analysis of the soluble and the insoluble fractions.

Résumé

Contexte: Les « lytic polysaccharides monooxygenases »(LPMO) actives sur la cellulose, sécrétées par les champignons filamenteux, jouent un rôle important dans la dégradation de la biomasse lignocellulosique récalcitrante (Bennati-Granier et al., 2015). Ils peuvent se présenter sous la forme de protéines multidomaines fusionnées à un « Carbohydrate Binding Module » (CBM). Sur le plan biotechnologique, les LPMOs sont des outils prometteurs et innovants pour la production de nanocelluloses et de biocarburants (Villares et al., 2017), mais leur action directe sur les substrats cellulosiques.

Résultats: Dans cette étude, nous avons étudié l'action (CBM1) lié à la LPMO9H de Podospora anserina (PaLPMO9H) en utilisant des substrats cellulosiques modèles. La suppression du CBM1 a affaibli la liaison à la cellulose nanofibrillée, à la cellulose amorphe et cristalline. Bien que la libération de sucres solubles de la cellulose ait été considérablement réduite dans des conditions normales, la LPMO tronquée a conservé une certaine activité sur les oligosaccharides solubles. L'action cellulolytique de la LPMO tronquée a été démontrée à l'aide d'expériences de synergie avec une cellobiohydrolase (CBH). En effet, la LPMO tronquée cellulose tout comme la LPMO avec CBM1. L'analyse de la fraction insoluble des substrats cellulosiques évaluée par microscopie optique et à force atomique a confirmé que le module CBM1 n'était pas strictement nécessaire pour favoriser la perturbation du réseau de cellulose. Sur la base de ces résultats, nous avons réduit la quantité d'eau dans la réaction pour augmenter la probabilité d'interaction enzyme-substrat dans un contexte sans CBM. L'augmentation de la concentration en substrat et la réduction de la quantité d'eau ont amélioré les performances de PaLPMO9H sans CBM en termes de libération de produits. Il est nation du CBM a modifié la régiosélectivité de PaLPMO9H avec une libération importante de produits oxydés en C1. Ces résultats fournissent des informations sur la cellulose pour produire des nanocelluloses et des biocarburants.

Abstract

Background: Cellulose-active lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) secreted by filamentous fungi play an important role in the degradation of recalcitrant lignocellulosic biomass (Bennati-Granier et al., 2015). They can occur as multidomain proteins fused to a carbohydrate-binding module (CBM). On a biotechnological point of view, LPMOs are promising and innovative tools for the production of nanocelluloses and biofuels (Villares et al., 2017) but their direct action on cellulosic substrates is not fully understood.

Results: In this study, we probed the action of the family 1 CBM (CBM1) appended to the LPMO9H from Podospora anserina (PaLPMO9H) using model cellulosic substrates. As expected, the deletion of the CBM1 weakened the binding to nanofibrillated cellulose, amorphous and crystalline cellulose. Although the release of soluble sugars from cellulose was drastically reduced under standard conditions, the truncated LPMO retained some activity on soluble oligosaccharides. The cellulolytic action of the truncated LPMO was demonstrated using synergy experiments with a cellobiohydrolase (CBH). Indeed, the truncated LPMO was still able to improve the efficiency of the CBH on cellulose nanofibrils in the same range as the full length LPMO. Analysis of the insoluble fraction of cellulosic substrates evaluated by optical and atomic force microscopy confirmed that the CBM1 module was not strictly required to promote the disruption of the cellulose network. Based on these results we reduced the amount of water in the reaction to increase the probability of enzyme-substrate interaction in a CBM-free context. Increasing the substrate concentration and reducing the amount of water enhanced the performance of PaLPMO9H without CBM in terms of products release. Interestingly, removing the CBM altered the regioselectivity of PaLPMO9H with a significant release of C1 oxidized products. These results provide insights into the mechanism of action of fungal LPMOs on cellulose to produce nanocelluloses and biofuels.

Composition du jury

• Gabrièle Véronèse -Directrice de recherche INRA Toulouse
• Evangelos Topakas -Associate professor National technical university of Athens
• Caroline Rémond -Professeur Université de Reims Champagne Ardennes
• Philippe Delavault -Professeur Université de Nantes
• Bernard Cathala -Directeur de recherche INRA Nantes-Dir. de thèse
• Jean-Guy Berrin -Directeur de recherche INRA Marseille- Co-dir. de thèse
• Ana Villares -Chargée de recherche INRA Nantes- Co-encadrante de thèse